独家丨基于久经临床考验的下一代测序技术平台,利用基因编辑和T细胞免疫全面防治肿瘤!


作者丨张楠

这个故事可以从最近的一个重磅新闻说起。11月16日,美国FDA宣布全球著名的斯隆•凯特琳癌症研究中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center,简称MSK)基于二代测序技术的癌症基因检测分析平台MSK-IMPACT™获得批准。这被视为2017年又一重大科学成果,影响深远,将开辟癌症基因检测的学术研究和商业化先河。

MSK-IMPACT由MSK开发,是一个全面检测癌症的平台,能一次性对病人肿瘤468个基因的基因突变及遗传变异进行快速灵活的检测。据了解,MSK-IMPACTTM检测平台之所以能获批,源于MSK近期完成的一个著名科学研究,结果发表已在2017年5月8日的《Nature Medicine》上。

《Nature Medicine》文章显示,MSK研究者利用MSK-IMPACT对超过1万名晚期癌症患者进行了基因测序。这是迄今为止癌症患者中规模最大的肿瘤测序研究,也是具有里程碑意义的重要研究,为全球癌症诊疗开创了新模式。

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(MSK发表的文章)

虽然MSK-IMPACT技术归MSK所有,但在实际研究中,尤其是涉及RNA检测基因融合的部分,MSK却采用了一种更先进的“AMP(Anchored multiplex PCR,锚定多重PCR)”专利技术,而不是MSK独家研发的MSK-IMPACT

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(MSK发表文章中关于运用AMP检测技术部分)

该AMP技术是由恒特基因联合创始人、首席科学顾问郑宗立博士在哈佛医学院工作期间发明,2014年成果发表在《Nature Medicine》上。当年该发明问世后,美国哈佛医学院麻省总院的综合诊断中心随即采用,目前已作为主要检测技术得到广泛应用。
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(郑宗立博士2014年发表AMP文章)

替代金标准FISH的AMP技术

实体肿瘤病理组织中携带突变的癌细胞占所有细胞比例可低至1~5%,而血液中游离突变DNA的含量占总游离DNA可低至0.1%,或更低。所以,同时满足多位点、高灵敏度检测需求的新技术成为精准医学检测的关键所在。

目前,对指定基因位点进行富集再测序的技术可分为杂交捕获和多重PCR两大类。杂交捕获技术作为传统方法,不少生物公司在探索创新,试图改进以往捕获效率低,样本使用量高,操作复杂等弊端;而多重PCR技术虽然操作简便、灵敏度高,但由于反应体系中不同引物可能相互干扰,使得结果均一性较差,造成部分位点的漏检,市场上很多公司难以克服上述瓶颈。郑宗立博士攻克了多重PCR的设计难关,开发出独特的多重PCR反应体系,采用全新的分子条码设计,实现了多位点的均一覆盖及超高灵敏度的液体活检要求。

郑宗立博士介绍,福尔马林固定的石蜡组织样本(FFPE)中,DNA和RNA常有断裂、损坏等问题,是肿瘤分子诊断的难点。而AMP技术是一种为NGS生成富集目标序列文库的快速、简单、易扩展的方法,适用各种类型、质量参差不齐的临床样本,特别是微量DNA和RNA样本,能在数小时内轻松建成测序文库。

数据显示,AMP技术于2013至2015年累计了一万例以上的临床应用验证,结果证明拥有100%的临床灵敏度和100%临床特异性(实测986份样本;检测成功率97%,成果发表于2014年Nature Medicine)。正因其具有高效稳定、高灵敏度、高特异性等优势,成为美国麻省总院主要的肿瘤分子病理检测方法。作为比较,据文献报道,Foundation Medicine的杂交捕获方法的检测成功率是85%(Nature Biotechnology,2013;注:还只是针对DNA检测的成功率,而不包含更不稳定的RNA)。

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(来源:美国麻省总院网站)

“也因为结果理想,我的导师John Iafrate(曾为FDA编写FISH法检测基因融合的标准实验流程)在自己的实验室已将金标准FISH法全替换成了AMP法了。” 郑宗立博士曾在采访中表示。

AMP最突出的优势是能发现和检测新的融合基因。麻省总院研究人员曾应用 AMP 技术,相继发现ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK 3 等新的基因融合,ROS1 还被证实对克唑替尼敏感。这帮助医生准确诊断ROS1病例(其他方法常常检测为阴性),效果很显著,该成果也发表于2014 年 11 月的《新英格兰医学杂志》上。

实际上,除基因融合外,AMP也同时对其他变异类型进行检测,包括点突变、插入和缺失、拷贝数、RNA表达等,几乎覆盖所有突变类型,可以使用 DNA 或 RNA 为模板,能对数个至数百个基因同时进行平行检测。

促进基因编辑、细胞治疗从研发迈向临床

在2017年11月23日中国精准医疗产业领袖峰会上,郑宗立博士围绕基因编辑和细胞治疗等前沿科学技术做了主题报告。

他介绍,CRISPR可以对基因组内的任何基因进行修改,能高效地对任何生命体进行基因组“手术”。然而CRISPR基因编辑技术虽功能强大,但隐藏着巨大的安全隐患,因为切割不准确会造成脱靶。在应用上,我们在乎被编辑过的每一个细胞,因为哪怕仅有一个细胞因脱靶导致癌基因被激活或者抑癌基因被敲除,都会对患者的安全埋下隐患。

基于AMP技术平台的全基因组无偏寻找CRISPR脱靶技术(GUIDE-Seq)能全面、灵敏地找出CRISPR编辑脱靶位点。AMP技术平台是经过了临床考验的一个平台,并且获得了全美审查最严格的纽约州的认证。因此,基于AMP技术平台而开发的CRISPR脱靶找寻方法可以为各种以CRISPR为基础的细胞治疗的安全把关,包括CAR-T或TCR-T等疗法,将威胁因素找出来,推动CRISPR技术真正走向临床。

一次性检测所有突变、两种核酸的测序技术

继AMP技术之后,郑博士带领恒特基因开发出新一代的PANO-Seq全景测序技术。他创办的恒特基因由此成为全球少数拥有自创反应体系的公司之一。PANO-Seq首创单管集成 DNA + RNA 同时检测,并在试剂和算法上取得突破,以满足液体活检对灵敏度和特异性的更高要求,在一个反应管体系内一次完成所有变异类型及两种核酸的“全景测序”目的。

据了解,PANO-Seq技术的样本来源更灵活,可选取实体肿瘤的手术切块、穿刺样本、石蜡切片或血液肿瘤的全血,或上述组织来源的DNA和RNA等;检测涵盖多个抑癌基因全编码区及肿瘤驱动基因的突变多发区域。

贝壳社了解到,继郑宗立博士完成PANO-Seq专利技术发明后,恒特基因正在进行全新产品的转化升级和商业开发。

首先是针对临床检测基因融合困难这一痛点,以提高融合检测质量为主,同时涵盖其它突变类型。恒特基因CEO周鹤梅女士告诉贝壳社,基因融合现象在癌症检测中非常重要,当前很多癌症检测不出变异基因,有一大部分就是因为发生了基因融合。“目前国内很多肿瘤医院专家在跟我们合作,因为很多样本用不同技术、不同公司检测结果都不稳定,所以想用恒特基因更全面的技术再检测一次。”

2017年ASCO大会上,有报告指出只要检测出NTRK基因融合,LOXO-101(TRK抑制剂)对不分组织来源的13种癌症都有疗效,有望成为第一个上市的“广谱靶向药物”。周鹤梅女士认为,现阶段已知的基因融合还是少数,但郑博士发明的技术能发现新的融合类型,也为后续靶向药物开发提供线索,所以融合基因检测在未来必然会成为趋势,今后人们会越发意识到其重要性。“所以我们的技术一直走在市场前面”,她说到。

今年3月,恒特基因还与中山市肿瘤研究所建立合作,前瞻性开展大型高危人群连续跟踪样本库研究项目,为大规模队列研究打下基础。据悉,该项目就利用PANO-Seq技术,对中山市肿瘤研究所收集的大量样本进行肿瘤游离核酸(ctDNA)全面检测,为肿瘤早筛积累数据,提早布局。

恒特基因的另一个新方向是针对下一代肿瘤精准医疗测序,从T细胞而非传统的肿瘤细胞视角为突破口进行测序,破解肿瘤难题。

针对肿瘤,郑宗立博士更偏向观察T细胞层面,因为T细胞能反映整个机体对肿瘤的免疫状态。他解释,传统检测方向是跟踪肿瘤,需要检测越来越多的基因,但可能抓住T细胞效果更好,是以不变应万变的策略。“T细胞身上有识别肿瘤的钥匙,是否可以借助T细胞达到深入全面了解肿瘤的目的呢?这把钥匙是真正的Holy Grail(圣杯),其应用可覆盖精准免疫治疗与精准预防,用于制备治疗性疫苗的蛋白质工程和肿瘤早期发现”。恒特基因的PANO-Seq全景测序将致力于实现该目标,开展对T细胞的深入研究。

总体而言,恒特基因利用PANO-Seq全景测序技术向两大方向持续发展,一个是肿瘤病理检测,指导用药检测、伴随诊断和肿瘤早筛检测等应用;另一个方向是致力于提高基因治疗、细胞疗法的安全性,为临床治疗提供更安全的保障。

恒特基因CEO周鹤梅女士坦言,作为具有多年海外生命科学管理工作经验的资深人士,她对恒特基因发展有非常清晰的认识。恒特基因今后将致力于为企业机构提供高质量产品和技术服务,眼光不局限国内,更放眼全球市场,参与国际竞争,力争让恒特基因成肿瘤防治,精准测序行业的领头羊。

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