基因疗法：是时候谈谈高剂量AAV了

近期有连续两起悲剧发生在ASPIRO 试验(NCT03199469)中，有两名儿童均接受了高剂量的AAV治疗XLMTM，结果却死于败血症。

其中XLMTM是一种罕见的新生儿神经肌肉疾病，患者会出现严重的肌无力和肌张力减退，从而导致呼吸衰竭和进食困难，进一步导致死亡，这种疾病是由MTM1基因突变引起的，其中MTM1基因编码肌管蛋白，是一种正常骨骼肌功能的必需蛋白。由于MTM1基因的突变从而导致患病。

而AT-132基因疗法使用AAV8载体递送肌管蛋白1基因拷贝，补充功能缺失的基因从而达到治疗的效果。根据ClinicalTrials.gov的资料显示，在迄今进行的180个AAV基因治疗介入试验中，有214例使用了AAV8(表1)。且在迄今为止用AAV8治疗的近250名患者中，没有出现这种级别的其他严重不良事件，进一步突出了这种衣壳迄今为止极好的安全性。

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，具有安全性好、宿主细胞范围广和在体内表达时间长等特点，因此成为目前最有前景的基因治疗载体。腺相关病毒(AAV)载体在骨骼肌基因治疗，肝脏基因治疗，中枢神经系统基因治疗，视网膜退行性疾病的基因治疗以及心脏相关疾病的基因治疗等方面都有应用。

研究人员可能为了进一步提高疗效所以采取了更高剂量的治疗方案，此次事件中，死亡的两个男孩都属于试验中的高剂量组。通过静脉注射使得他们每千克体重(vg/kg)获得了3×10¹⁴载体基因组。这是有史以来给成年人或儿童服用的最高AAV剂量之一(见表2)。而且根据试验发起人的陈述，两个男孩都处于较高的限定年龄(不到5岁)。

也就是说如果我们假设这些男孩是4岁，并且他们的体重偏轻，那么如果他们接受超过4×10¹⁵ vg的剂量，体内的AAV剂量将严重超标。高剂量AT-132队列中的三名男孩出现了严重的肝胆疾病(肝脏和胆管损伤)可能也与高剂量AAV相关的。因为几乎所有的AAV疗法都是通过静脉注射输送到肝脏的，所以肝脏必须控制这些大剂量的病毒，尤其是如果肝脏事先受损的话，将会导致毒性。其中死亡的两名男孩在治疗前均存在不同程度的肝脏疾病。

早在2018年，基因疗法开拓者Jim Wilson教授指出将剂量太高可能会导致安全问题。Wilson团队在Human Gene Therapy杂志上发表了一篇题为Severe Toxicity in Nonhuman Primates and Piglets Following High-Dose Intravenous Administration of an Adeno-Associated Virus Vector Expressing Human SMN 的文章，指出了使用高剂量基因疗法的动物会导致肝脏和神经系统损伤，并呼吁研究人员进行更多监测。

与之相关的是，在接受高剂量全身AAV治疗的患者中也发生了其他一些严重的不良事件(其中严重程度不同)(表3)。这些不良事件主要是由于静脉给药后几天至几周的先天免疫反应(如炎症和补体激活)和细胞免疫反应所致。

目前我们还不清楚试验中的AAV8载体是如何制造的，使用了什么样的纯化方法，以及通过改变是否能提高该剂量的安全性。除了满足试验纳入标准(未公开披露)之外，这些男孩先前存在的AAV8抗体的水平也未可知。因为目前还没有一种标准化的方法来测量预先存在的抗AAV病毒衣壳水平，这仍然是该领域的一个巨大挑战。

如何选定安全的AAV剂量需要通过额外的临床前研究来更好地预测，以及毒性生物标志物，空衣壳水平、生产方法产生的杂质和不同纯化策略等参数的影响。

从长远来看，我们除了能够安全使用高剂量还应考虑如何选择更适合的载体，这可以从以下几个方面得到解决:

• 寻找更适合目标器官的工程衣壳。
• 组织、环境特异性和可移植控制的新启动子和调节元件。
• 找到更安全的生产方法，可同时满足生产需求，同时减少杂质(宿主蛋白质和不需要的核酸)。
• 在媒介生产过程中增加对AAV生物学的进一步理解。
• 寻找新颖且更稳定的反向末端重复(ITR)基因组结构。
• 设计更好的纯化方法，进一步减少杂质负担。
• 避免免疫反应的创新策略。
• 创建新的管理方法。

除了以上各方面，我们还应该考虑疾病与剂量之间的关联。如果两个体重相同的孩子有明显不同严重程度的疾病，是否应该给予他们相同的载体剂量？或者性别是否对药物有什么影响？

许多研究小组已经观察到AAV明显的两性异形肝脏转导，男性经历了明显更大的转导，因此可能比女性得到更高的表达。而对于两性异形转导，我们在决定AAV剂量时有一些数据可以参考。但是对于不同发育状态和疾病严重程度的剂量问题，目前还严重缺乏临床前数据。

基因治疗还有一段路程要走，如何做到安全、有效是我们共同期待的目标。